Biotechnologie : application des principes scientifiques et de l’ingiéneurie à la transformation de matériaux par des agents biologiques pour produire des biens ou des services.
Infox : Tous les cours de BTS sont issus de la filière BTS biotechnologie du lycée la Martinière-Duchère, à Lyon 9.
Production de protéines hétérologues ou protéines recombinantes
Introduction
Protéine recombinante/hétérologue : protéine qui n’est pas synthétisé naturellement par l’organisme qui la produit. L’organisme lui-même est dit recombinant et il a été obtenu par génie génétique.
C’est une technique qui est extrêmement rependu et qui permet de produire et de purifier une protéine donnée en grande quantité afin de :
- l’étudier (propriété biologique, structure…)
- la commercialiser à des fins thérapeutique (insuline, planticorps…) ou industrielle (ATB)
- produire des Ac contre la protéine donnée
- produire des protéines modifiées présentant de nouvelles propriétés.
Le principe est de sous cloner le gène complet de la protéine en aval d’un promoteur fort permettant une transcription importante. Le plasmide recombinant est ensuite placé dans une souche adaptée à la production. Dans le cas d’un gène eucaryote, on utilise un ADNc (sans introns) obtenu par RT-PCR à l’aide d’amorces dégénérées possédant des sites de restriction compatible et permettant un clonage directionnel.
Remarque : il faut faire attention aux problèmes de codons rares lors de la production de protéines hétérologues. En cas de présence de codons rares dans la séquence, la souche ou la bactérie possède peu d’ARNt correspondant et la production sera donc limitante. Il existe deux stratégies pour contourner ce problème :
- remplacer les codons par mutagénèses dirigées (mutation silencieuse)
- utiliser des souches ou bactéries surproduisant des ARNt naturellement rare
Un vecteur d’expression procaryote comprend systématiquement les éléments suivants :
- promoteur fort, le plus souvent inductible en amont de la séquence clonée
- site de fixation des ribosomes : traduction des protéines (RBS)
- étiquette ou tag généralement insérer dans le polylinker qui permettra une protéine de fusion facilement détectable et purifiable, souvent par chromatographie d’affinité. Cette étiquette peut être placée en N ou C terminale
- signal de terminaison transcription-terminateur
- signal Ori et un gène de résistance à un antibiotique (ATB)
L’expression de protéines hétérologues se fait la plupart du temps après une première étape de croissance de la bactérie :
- 1er raison : production de biomasse. La machinerie cellulaire étant recrutée par la production de la protéine endogène ou homologue. Ainsi, lors de l’induction, cette même machinerie sera presque exclusivement utilisée pour la production de la protéine d’intérêt.
- 2nd raison : cette induction a un moment précis permet de protéger les bactéries ou les cellules contre la toxicité fréquente des protéines hétérologues accumulées. On tente donc de limiter le plus possible leur expression pendant la première phase de croissance.
Il existe donc différents systèmes d’induction :
- promoteur de l’opéron lactose inductible par IPTG
- pET (E. coli BL21(DE3)). La souche hôte possède le gène phagique de la T7 RNA polymérase sous contrôle du promoteur-opérateur lactose. En absence d’IPTG, la T7 RNA polymérase est produite à un niveau basal ; hors, celle-ci est inhibée par le lysozyme du phage T7 produit en faible quantité à partir d’un autre plasmide. Par contre, après induction, l’inhibiteur est en trop faible quantité pour continuer à inhiber la T7 RNA polymérase. Celle-ci pourra alors transcrire le gène d’intérêt cloné en aval du promoteur T7. comme seul ce gène est sous la dépendance de ce promoteur, il sera produit en très grande quantité (figure 6)
De plus en plus, la purification est effectuée par chromatographie d’affinité à l’aide de TAG sur des protéines de fusion.
Protéine de fusion : c’est une protéine qui est issu d’un gène chimère (combinaison de deux gènes différents) et différents cadres de lecture sont liés de façon à ce que leur séquence codante soit en phase. La construction résultante est transcrite puis traduite comme un seul gène produisant une seul protéine. Cette technique est très utilisée pour :
- additionner à la protéine un marqueur d’affinité
- produire une protéine ayant les activités de deux protéines distinctes
- de créer des gènes rapporteurs suivant l’expression exacte d’un gène d’intérêt (voir 3.)
Leurs formations sont favorisés par la précipitation de la protéine exprimée, par la quasi-absence de protéines chaperonnes ou de modifications post-traductionnelles ou encore par un environnement réducteur du cytoplasme.
On peut purifier ses corps d’inclusion par lyse de la culture bactérienne, puis par centrifugation à basse vitesse (500 à
Les avantages sont qu’il y a pas de protéolyse de la protéine agrégée, il n’y a pas de toxicité de la protéine vis-à-vis de la cellule, la purification est simple et peu couteuse, et de grandes quantités sont accumulées. Le principal inconvénient survient si l’on doit renaturer la protéine in vitro : les rendements sont inversement proportionnels à la concentration de la protéine.
Il faut pour cela utilisé des vecteurs comportant des promoteurs thermo-régulés (ex : cspA). Pour la production, il y a une première phase d’expansion de la bactérie à
Il faut pour cela l’ajout d’une séquence signal procaryote (phoA, OmpA) en
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Avantages |
Inconvénients |
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Croissance rapide et peu onéreuse Non pathogène pour l’homme Système génétique bien connu, nombreuses souches améliorées. Expression des gènes contrôlable Nombreux vecteurs d’expression disponibles, facilité de transfection dans les cellules hôtes Bons rendements de production des protéines (plusieurs dizaines de gramme par litre de culture) Corps d’inclusion cytoplasmique : facilité de purification |
Influence du vecteur sur le taux de croissance cellulaire, la consommation d’énergie Pas de modification post-traductionnelle, activité biologique différente de la protéine native. Corps d’inclusion : protéines insolubles ou mal repliée Sécrétion dans l’espace périplasmique : rendement moins important. Présence d’endotoxine bactérienne |
C’est le système de référence lorsque l’on travail avec une protéine sans modification post traductionnelle.
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Avantages |
Inconvénients |
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Petit génome eucaryote facilement manipulable et bien caractérisé Absence d’endotoxine Fermentation peu couteuse Bons rendements (quelques grammes par litre de culture) Modifications post traductionnelles simples Possibilité de sécrétion de la protéine d’intérêt |
Hypoglycolysation N-glycosylation : immunogène pour l’Homme Mauvais repliement de la protéine produite |
2.3. Expression dans les cellules d’insecte
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Avantages |
Inconvénients |
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Croissance rapide des cellules en suspension Bons rendements de production ( qql centaines de mg/L de culture) Modifications traductionnelles poussées : - reconnaissance de signaux d’adressage hétérologue - clivage des pro-peptides et peptide signal - assemblage de complexe oligomérique - formation de ponts dissulfure - repliement - modifications chimiques |
Système de fermentations particuliers (sans apport CO2, Glycosylation Production couteuse (mort des cellules si infection par baculovirus) |
Avantages :
- Nombreux vecteurs d’expression disponibles
- Maturation proche le la protéine native, profil de glycosylation complet si utilisation de cellules humaines
Inconvénients :
- culture des cellules difficile et couteuse
- croissance lente
- cellules recombinées peu stable (perte de vecteurs)
- faible rendement (de l'ordre de 10 mg/ L de culture)
- peu de recul sur la sécurité virale (lignée cellulaire transformées)
Ce système devient de plus en plus poussé et efficace, mais en contrepartie, de plus en plus dure de mettre en place.
Aujourd’hui, dans le monde, une centaine de produits pharmaceutiques, obtenus par production de protéines hétérologues (recombinantes ou non) sont commercialisés :
- vaccins
- anticorps thérapeutique
- interférons
- facteurs sanguins
- facteur de croissance hématopoïétique
- hormones de croissance
- interleukine
Cette fabrication a plusieurs intérêts :
- La synthèse biologique est plus simple et moins couteuse que la synthèse chimique (sauf dans le cas de petits peptides).
- La purification de protéines taguées est beaucoup plus simple que la purification de protéines naturelles extraites de liquide biologique.
- Le risque de contamination par un agent pathogène est très limité (hormone de croissance)
Elle permet de trouver des partenaires à une protéine donnée qui, en interagissant physiquement avec elle, sont susceptibles de participer aux mêmes phénomènes. Une des stratégies les plus employées est celle du double hybride chez la levure, mis au point par Stanley et al. en 1989. Le système est basé sur le fait que la plupart des activateurs transcriptionnelles eucaryotes possèdent deux domaines :
- un domaine de liaison à l’ADN (binding domaine BD) qui se lie à une séquence spécifique proche du promoteur.
- Un domaine d’activation (activating domaine AD) qui active la transcription en interagissant avec l’ADN polymérase.
Ces deux domaines sont non fonctionnels s’ils sont séparés. Le système de double hybride est basé sur l’insertion de deux vecteurs différents chez la levure codant 2 gènes artificiels :
- le premier gène code pour la protéine APPAT (protéine X) dont on veut identifier les partenaires. Ce gène est fusionné avec BD.
- Le second gène code pour la protéine PROIE (protéine Y, partenaire potentiel de la protéine X), qui est aussi fusionné, mais à AD.
Par cotransfection des deux vecteurs, les deux protéines de fusion sont exprimées dans les levures qui possèdent un gène rapporteur dont l’expression est contrôlée par une séquence UAS (Upstream Activating System) spécifique du domaine de fixation GAL4-BD.
De très nombreuse protéine PROIE peuvent être testée grâce à l’existence de banque spécifique. Lorsque deux protéines interagissent entre elles, elles permettent l’expression du gène rapporteur.
L’analyse du profil d’expression d’un gène (ou d’une protéine) au sein d’un organisme passe par des marquages anticorps ciblant la construction d’organisme transgénique doté de gènes rapporteurs. L’organisme transgénique exprime la protéine fusion selon le même paterne spatio-temporelle que la protéine endogène. Ainsi, on peut suivre son expression dans les différents tissus au cours du temps et /ou dans différents contextes génétiquement mutant.