Biotechnologie : application des principes scientifiques et de l’ingiéneurie à la transformation de matériaux par des agents biologiques pour produire des biens ou des services.
Infox : Tous les cours de BTS sont issus de la filière BTS biotechnologie du lycée la Martinière-Duchère, à Lyon 9.
Chapitre 4 : les puces à ADN
Le séquençage de ces 15 dernières années, et plus récemment avec le shotgun, a permis d’obtenir les séquences complètes ou partielles de plusieurs milliers de génome d’espèce eucaryote ou procaryote, dont l’Homme, le chien, la souris…
Aujourd’hui, il reste à décrypter ces séquences, identifier les gènes et leur profil d’expression (quantitatif et qualitatif) et leur fonction. Cette tache est réalisée par l’analyse du transcriptome et/ou du protéome.
Transcriptome : c’est l’ensemble des gènes exprimés sous forme d’ARNm d’un tissu ou d’une population cellulaire à un moment donné et dans des conditions données. L’analyse du transcriptome à grande échelle a été possible grâce à la mise au point de puce à ADN.
Une puce à ADN (ou DNA microarray) est constitué de fragments d’ADN immobilisés sur un support solide (aujourd’hui) selon une disposition ordonnée. Le fonctionnement repose sur le même principe que le Southern ou le Northern Blot, qui sont couramment utilisé pour détecter et quantifier une séquence nucléique spécifique dans un échantillon biologique par hybridation avec une sonde complémentaire marquée. La mise au point des puces à ADN a permis d’étendre ce principe à la détection simultanée de milliers de séquences en parallèle. En effet, une puce comporte quelque centaine à plusieurs milliers de zones d’hybridation, appelé spots, chacune étant constitué d’un dépôt de fragments d’ADN ou d’oligonucléotides correspondant à des séquences connues de gènes. Ainsi, après hybridation, on pourra détecter et quantifier l’ensemble des cibles que contient une puce en une seule expérience.
On distingue différents types de puces selon la densité des spots, le mode de fabrication et la nature des séquences nucléotidiques fixée (voire figure 2)
Les premières puces mises au point, appelé macroarray, étaient sur des membranes de nylon en 1995. Depuis le début des années 2000, elles sont réalisées sur des lames de verres. L’utilisation d’un support solide, de marqueurs fluorescents et des progrès de la robotique permettent de fabriquer des puces avec une très haute densité de spots, susceptible ou capable de couvrir l’ensemble du transcriptome d’un organisme sur une lame de microscope. (Le revêtement le plus couramment utilisé est la polylysine, qui permet l’adhésion de l’ADN.
Les dépôts (sondes) sont des clones d’ADNc ou des produits de PCR fixé sur une membrane de nylon de 8 par 12 cm. Le marquage des cibles est radioactif (P32). Elles permettent une mesure de l’abondance relative des ARNm présent dans l’échantillon de départ.
Les sondes sont des ADN doubles brin de 200 à 2000 paires de bases, amplifié par PCR ou plus récemment des oligonucléotides longs (50 à 70mères (unités)). Des microgouttelettes (spots) de ces solutions de sondes sont déposées selon une matrice d’emplacement défini à une densité supérieur ou égale à 1000 sondes/cm2 par un robot sur des lames de verre (jusqu’à 12000 sondes). En général, un spot correspond à un gène donné.
Dans le cas de produit de PCR, l’ADN de la puce doit être dénaturé pour obtenir de l’ADN simple brin.
Ces puces renferment des oligonucléotides simples brin synthétisé in situ (directement sur le support) par photolithographie (figure 3). Ce type de puce permet donc une miniaturisation à l’extrême (250 000 spots/cm2) et une grande précision dans l’analyse du gène est représenté, car une quinzaine de sonde couvre un même gène, mais sur des portions différentes.
L’utilisation des puces spotées permet d’obtenir une mesure relative directe du niveau d’expression des gènes dans un échantillon cellulaire par apport à un échantillon de référence.
Quelque exemple : comparaison souche mutée/souche sauvage ; effet d’une toxine/produit pharmaceutique ; changement métabolisme aéro/anaérobie ; phase d’apprentissage/repos…
La première étape pour fabriquer une puce est de préparer des fragments d’ADN de sonde spécifique de chaque ORF du génome étudié. Différents matériels peut être utilisé :
Amplicon d’ORF entiers (figure 5), les séquences complètes des ORF et/ou des intergènes sont déposés sur la puce. Ce type de sonde présente l’avantage de permettre la réalisation d’expérience ChIP on CHiP (voir 4.1). L’inconvénient principal est que les gènes présentant une forte homologie entre eux (supérieur à 70%) ne peuvent être distingués après hybridation. Des phénomènes d’hybridation croisés (faux positif) peuvent donc avoir lieu entre 2 gènes proches au niveau de leurs séquences nucléotidiques globales.
Produits PCR d’une portion déterminé d’ORF, certaines sociétés proposent des banques d’amorces capable d’amplifier des fragments de taille constante (environ 1kb), et relativement spécifique à chaque ORF (par analyse bioinformatique), ce qui évite les hybridations croisés entre gènes homologues.
Des oligonucléotides longs (50 à70mères), aujourd’hui, le développement de banque d’oligonucléotides permet de s’affranchir des problèmes d’hybridations croisées en choisissant les séquences des sondes dans des régions non conservées de chaque gène. Cette alternative permet aussi de réduire les couts et le temps de préparation part apport à l’amplification PCR. De nombreux fournisseurs proposent ces banques d’oligonucléotides prêts à spoter.
Pour une expérience donnée, une condition expérimentale (stress, drogue…) est comparé à une condition de référence. Les ARNm sont extraits des 2 types de cellules et sont retranscris en ADNc par la RT (voire figure 6). Au cours de cette retro transcription, les ADNc issu de la condition de référence sont marquées par une molécule fluorescente, et les ADNc issus de la condition expérimentale sont marqués par une autre molécule fluorescente. Les fluorophores les plus utilisés sont la cyanine3 sous forme de Cy3dNTP et la cyanine5 sous forme de Cy5dUTP.
Les ADNc en rouge et en vert sont mélangés et placés sur la puce. Celle-ci est incubée à environ 60°C pendant une nuit. Ces cibles fluorescentes vont donc s’hybrider. Cette hybridation est compétitive : plus la concentration de l’ADN cible est élevée, plus il s’hybridera sur la sonde (voire figure 7). En conséquence, l’intensité de fluorescence verte ou rouge traduit l’hybridation préférentielle de l’ADNc témoin ou de l’ADNc de l’expérience. L’intensité de fluorescence traduit donc la concentration relative des ARNm dans chaque condition. Ceux-ci sont soit surexprimé (induits), exprimé de la même manière ou sous exprimés (réprimés)
Chaque spot de la puce est excité par un laser et on enregistre la fluorescence émise à une longueur d’onde (rouge, puis vert). On obtient alors 2 images que l’on peut superposer artificiellement pour obtenir une image unique composée de spots allant du vert (ADN de la première condition) au rouge (ADN de la seconde condition) en passant par différentes variations du jaune (ADN des deux condition fixés en quantité plus ou moins identique) (figure 7). Après normalisation des signaux, on calcul le rapport (ou ratio) fluorescence rouge/ fluorescence verte. Si ce ratio est supérieur à 1, le gène est surexprimé dans la condition expérimentale. Au contraire, si le ratio est inférieur a 1, le gène est sous exprimé. Pour être significatif, la modification d’expression d’un gène donné doit correspondre à un ratio de plus ou moins 2. Les gènes identifiés peuvent ensuite être classés en fonction du niveau de leur sur ou sous expression de façon à être révéler des ensembles de gènes impliqués dans une fonction commune (voire figure 8)
La technique ChIP on CHiP
La méthode Chromatin ImmunoPrecipitation (ChIP) sur puce a été développé afin d’identifier des sites d’interaction de protéines, tel que des facteurs de transcription avec des régions d’ADNg. Cette technique a été principalement utilisée chez la levure (génome de taille réduit et bien connu). (Figure 9)
Voir chapitre sur la cartographie
Cette technique permet de détecter la variation du nombre de copies d’ADN (amplification ; délétion) impliqué dans de nombreuses pathologies tel que les maladies de développement embryonnaire ou des cancers. L’hybridation sur des puces, présentant des portions connues du génome, permet de cartographier des réarrangements génomiques avec une résolution de plus en plus élevée.
Cette technique représente une avancée majeure dans l’étude de l’expression des gènes et de leur rôle dans différentes conditions physiologiques. D’une part, elle permet l’analyse quantitative beaucoup plus fine que les méthodes traditionnelles (Nothern Blot) et d’autre part, elle permet l’analyse d’un transcriptome complet en quelques semaines (si les puces sont disponibles) alors qu’il fallait jusqu’ici parfois des années pour identifier en aveugle un gène dans un processus donné sur la base de la modification de son expression dans une situation donnée.
Les applications sont très nombreuses. Les puces commerciales sont de plus en plus nombreuses, plus accessibles, et il existe de nombreuse plateformes de fabrication et d’analyse des puces ADN.
L’évolution du nombre de publications utilisant cette technique prouve son intérêt (figure 11)
Schéma de synthèse de création de puces