Biotechnologie : application des principes scientifiques et de l’ingiéneurie à la transformation de matériaux par des agents biologiques pour produire des biens ou des services.
Infox : Tous les cours de BTS sont issus de la filière BTS biotechnologie du lycée la Martinière-Duchère, à Lyon 9.
PCR classique et PCR en temps réel
Mise au point par Kary Mullis en 1985, cela lui vaut le prix Nobel en 1995. Le principe est rappelé dans les cours de génie génétique de B1.
PCR Hot Start
Elle permet d’éviter l’amplification de dimères de primers.
Pour cela, un des composants nécessaire à l’élongation (taq ou MgCl2 par ex) est ajouté après la première dénaturation, et dont l’élongation commence à
PCR nichée ou emboitée
1ère PCR beaucoup moins spécifique que la seconde.
1ère PCR courte, entre 20 et 25 cycles, la seconde PCR est plus longue.
PCR Touch Down
En deux temps :
- les 1er cycles, où il y a une hybridation spécifique, mais une amplification légère
- au cycle suivant, il y a une température d’hybridation moins importante, donc moins spécifique, mais ce sont les fragments spécifiques de la 1er étape qui son amplifiés.
PCR multiplex (voir TP)
Limitation des contaminations
Autre que les moyens classiques, que sont le port de gant, travail sous hotte PCR…
L’autre stratégie est de remplacer le dDTP par du dUTP. Les réactions suivantes de PCR sont préparées en présence d’uracile-DNA-glycosylase, qui retirera l’uracile des contaminants lors de la préparation des échantillons. L’uracile-DNA-glycosylase sera dénaturé lors du premier passage à
Cette stratégie ne peut pas être utilisé en vue d’un clonage suivit de l’expression de la protéine.
Voir cours B1, TP de B2 et cours sur les banques d’ADNc (GGB2C4)
But : amplifier une séquence à partir d’un ARNm.
Définition : la PCR en temps réel permet de suivre cycle après cycle l’évolution de la réaction PCR et la quantité d’ADN cible synthétisé, et ce grâce à un marqueur fluorescent.
Une des applications majeur de la PCR en temps réel est qu’elle permet d’obtenir une quantification absolue ou relative de la quantité initiale d’ADN cible (ou ARN dans le cas d’une qRT-PCR), ce qui était très difficile à obtenir en PCR classique (PCR en point final). On parle alors de qPCR.
La cinétique d’une réaction PCR. Elle présente deux caractéristiques :
- l’amplification n’est pas exponentielle pendant toute la durée de la réaction
- la quantité d’amplicon final n’est pas proportionnelle à la quantité de matrice initiale
Donc, en PCR classique, on ne peut pas estimer la quantité de matrice de départ.
Notion de cycle seuil et proportionnalité avec la quantité de matrice de départ. Cycle seuil, c’est le nombre de cycle d’amplification nécessaire pour obtenir un signal fluorescent statistiquement différent du bruit de fond. De façon intéressante, le cycle seuil est fonction de la quantité de matrice de départ.
La quantification peut alors se faire de deux façons :
- quantification relative : on compare la quantité de matrice dans deux conditions dont l’une sert de référence. La quantité de l’échantillon essai est alors exprimé en % de référence.
- Quantification absolue : si on connaît le nombre de copie initialement présente dans l’échantillon de référence, on peut alors connaître le nombre de copies dans l’échantillon étudié.
Stratégie de quantification de l’ADN en temps réel. Toute les stratégies développées repose sur le suivit de la fluorescence à un moment donné du cycle de la PCR. Les thermocycleurs utilisés comprennent donc des fluorimètres et sont couplés à des ordinateurs qui enregistrent et traitent le signal.
L’intercalent le plus utilisé est le SYBER green qui se fixe à l’ADN, et on voit alors sa fluorescence augmenté. Il est plus sensible que le BET et n’inhibe pas la taq polymérase. Plus la quantité d’ADN augmente, plus la fluorescence augmente. Celle-ci est mesurée en fin d’étape d’amplification.
Avantage : pas chère et facile de mettre en œuvre.
Inconvénient : peu spécifique. Le SYBER green s’intercale entre n’importe quelle double hélice d’ADN. Il est impossible en cours de réaction de savoir si l’amplification est spécifique. On palie aux problèmes de spécificité en effectuant spécifiquement une courbe de fusion en fin de PCR. Cela permet de vérifier si l’amplification est spécifique (par la Tm) ou si la PCR a été contaminé (présente alors deux pics de Tm)
Cette stratégie est basée sur deux propriétés associées :
- l’activité exonucléasique de la taq (
- le quenching (atténuation) par FRET (Fluorescence Resonnance Energy Transfer)
Principe du Fret : c’est un phénomène par lequel l’énergie émise par un fluorochrome appelé reporter est transmise et absorbé par un autre fluorochrome appelé quencher qui réémettra à son tour cette énergie soit sous forme de lumière (à une longueur d’onde différente), soit sous forme de chaleur (donc pas de lumière)
- Sous clonage direct d’un gène
- Mutagénèse dirigé
- Détection et quantification d’OGM (par un gène de résistance à un ATB)
- Détection de microorganisme pathogène (voir TP)
- Test de paternité, médecine légale (voir TP)
- Estimation de la quantité de transcrit par qRT-PCR